摘要

作品简介:在O型血受试者的恶性细胞中有不相容A抗原表达的报道。虽然在10-20%的O型血患者中观察到这种现象，但A抗原表达不相容的遗传机制仍不清楚。

材料和方法:从7例已在肿瘤中表达不相容A的患者对应的22个乳腺蜡块中提取基因组DNA作为模板ab采用荧光、双链SSP-PCR进行基因分型。下一代测序(NGS)也对ABO血型基因的第6、7外显子进行了测序。

结果：4/7患者在正常和肿瘤DNA中进行基因分型O / O，在肿瘤DNA中的正常DNA和A / O中的3/7例是基因分型O / O.发现新的帧突变突变320Dela在等位基因O的外显子6中产生止轭码头。在表达抗原的肿瘤组织的3/7例中，除去缺失320，导致的止挡密码子不再存在，读取框不会改变因此合成糖基转移酶A.

结论:在O型患者中表达的不相容抗原来自于320位O等位基因缺失，该等位基因由一种与外显子6和7中的A转移酶类似的功能免疫反应蛋白产生。尽管A抗原在肿瘤生物发生中的生物学功能尚不清楚，但在肿瘤细胞表面表达A抗原可使其在临床上作为肿瘤预后的生物标志物。

关键词

ABH抗原;乳腺癌;不兼容的抗原;非deletional O;320年菲律宾人质

介绍

ABH抗原的合成需要转移酶的表达ab基因[1,2]。这个基因位于人类第9号染色体的远端长臂上。它由7个外显子组成，编码一个354氨基酸糖基转移酶。A、B、O型和亚型是基因内遗传变异的结果，这些变异影响酶的表达或活性，导致在红细胞(rbc)表面检测到的血型抗原的质量和/或数量的变化[3-6]。

遗传修饰已经报道了从上皮细胞[7,8]衍生的数种癌症是共同的。乳腺癌经常触发了膜结合糖，如BRCA1，BRCA2，和汤姆森-Friedenreich唾液酸Lewis抗原，其涉及在癌症发展中发生的糖基化状态的改变。其中糖缀合物，组织血型ABH抗原也假定在各种癌症中[9-12]将被牵连。

几项研究表明，当发生恶性过程时，通常表达ABH抗原的细胞可能部分丢失ABH表达。已经建立了A和B抗原的表达作为一种有利的预后因素，因为它们的还原或完全缺失与预后差的相关[13]。新创在包括结直肠癌在内的一些实体肿瘤中也观察到与胚胎生命相同的ABH抗原表达[6,14-16]。一些红细胞血型O表型的受试者可能在其恶性细胞[17]中表达不相容的A抗原。

很少有研究探索合成抗原的合成机制。克劳森和同事建议认为点突变可能发生在O.等位基因，恢复阅读框，导致a样转移酶的产生[18,19]。

然而，问题出现了给定的突变如何成为不同个体不同类型癌症的常见特征。已经提出了其他假设，例如使用第二个起始密码子O.n -截短的部分酶活性蛋白的产生或伪基因的激活。此外，还会发生选择性剪接，删除携带c.261G缺失的外显子6，生成缺失135个碱基对的转录本和缺失33个氨基酸[20]的蛋白。

随着发现的发现O.缺乏常见缺失的等位基因(O03）以7.3〜8％的频率，假设该等位基因有助于表达不相容的抗原。

我们筛选了患有RBC表型O的乳腺癌的7例，他被发现将血液组在免疫组织化学检测到的肿瘤中表达抗原，以便探讨涉及不相容的表达的机制。

装备和方法

道德的声明

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，由拉巴特大学医学院的拉巴特生物医学研究伦理委员会(CERBR)评估和批准。

组织样品

从乳腺癌，谁在通过免疫组织化学，肿瘤显示出不相容的A抗原的表达患有七RBC表型ø情况下，被选择用于研究。样品，即patientmatched正常（N）/肿瘤（T）的组织中，对从病理科，大学医院伊本Rochd（卡萨布兰卡，摩洛哥）乳腺肿瘤切除术或乳房切除术获得。将所有样品在福尔马林中固定，包埋在石蜡中和同时含有肿瘤和邻近的正常乳腺组织，所有表达A和H抗原，分别代表部分。

从福尔马林固定和石蜡包埋组织中提取DNA

对于每个样品，肿瘤和相邻的非癌组织串联，用手术刀刮擦并置于微管中以用二甲苯和绝对乙醇脱蜡。

使用QIAamp DNA FFPE tissue MinElute®试剂盒(Qiagen)手册从固定乳腺组织中提取基因组DNA，该试剂盒由制造商提供的“组织”协议推荐。提取的DNA用60 μL TE Buffer洗脱，-20℃保存后使用。

ab荧光，双相SSP-PCR基因分型

核苷酸位置c.261(PCR 1)和c.703(PCR 2)ab通过荧光，双相序列特异性底漆（ASP） - PCR（表1）分析基因。PCR反应在10μL的最终反应体积为10μl，用1x Hotstartaq PCR主混合物（QIAGEN），每个引物的0.4μm，0.5μm的通用U-FAM引物（表1）和2μL纯化的基因组DNA。

PCR.	Theoric大小(pb)	等位基因 特异性	底漆
			序列(5 '→3 ')
1	243.	一种或者B.	ABO_261G_F一种	gtttcttcagccaaaggtctgacaccccggaaggatgtcctcgtggtga.
	222.	O.	ABO_261X_F一种	GTTTCTTGTGGAAGGATGTCCTCGTGGTAC
	-	-	ABO_261C_RuFB.	GTCGTAGTCGACGACCGTTAAATGTCCACAGTCACTCGCCACT
2	153	B.	ABO_703A_F一种	GTTTCTTGTGGAGATCCTGACTCCGCTCCTCGGCACCCTGCACCACA
	133.	一种或者O.	abo_703g_f.一种	GTTTCTTGTTCGGCACCCTGCACCCGG
	-	-	ABO_703X_RuFB.	GTCGTAGTCGACGACCGTTAGAAATCGCCCTCGTCCTTGG
-	-	-	U-FAM	6-FAM-GTCGTAGTCGACGACCGTTA

表格1：荧光双相PCR-SSP的引物
^一种特异性正向引物，基因分型序列为GTTTCTT(下划线)。
^B.含有单序列GTCGTAGTCGACGACCGTTA（下划线）共同反向引物。

将扩增的PCR产物（0.5μL）与Genescan TM 500 Rox TM（Applied Biosystems）混合在去离子甲酰胺HI-DI-DIM（Applied Biosystems）中。产物在95℃下变性5分钟，然后在冰上置于冰上5分钟。然后通过毛细管电泳分离单链DNA片段在3130xL遗传分析仪（应用生物系统）中分离，并用Genemapper®软件分析所得到的电泳图。最终通过解释PCR1和2扩增结果来确定基因型。

ab测序

第6和第7个外显子ab用从正常和肿瘤细胞中提取的基因组DNA进行测序

我们获得了9次盖子的最小深度，为分析SNP提供了足够的深度。深度毯> 5倍显着。获得的序列与参考基因组对齐，并使用NCBI数据库和Ensembl分析以确认新突变对蛋白质的影响。如果发现的突变已经描述，我们在数据库中寻求。我们还对每个突变进行了对文献的研究。

在这里，我们仅报告是正常细胞和肿瘤DNA之间不同的突变。突变通过基于PCR的Sanger测序证实。

结果

ab荧光，双相SSP-PCR基因分型

在7例中，4/7是基因分型O./O.在正常和肿瘤dna中，3/7是基因分型的O./O.在正常的DNA和一种/O.(表2)。

样品标识	组织	组织表型(包含IHC)	基因型一种	核苷酸职位B.
				c.261	C.320	c.740
1 2 3 4	普通的	H	O / O.	G / delG	A /菲律宾人质	A / G.
	瘤	一种	O / O.	G / delG	A /菲律宾人质	A / G.
5、6、7	普通的	H	O / O.	G / delG	A /菲律宾人质	A / G.
	瘤	一种	一种/ o.	G / delG	一种/一种	一种/一种

表格2：在七种血液型血液型抗原患者的血液型和肿瘤组织中的基因型 - 表型
^一种基因型由荧光测定，双工SSP-PCR。
^B.核苷酸位点进行测序确定。
改变下划线;del：删除。

ab外显子测序和SNP滤波

ab在肿瘤中表达不相容的抗原的7名患者的基因测序揭示了两种新的不同突变，这既没有在数据库中也没有报告我们的知识。第一个突变是外显子6的单一碱缺失，即C.220Dela，其可能导致生产缺乏催化活性位点的非功能性产品（P.Glu107GlyFSX12）。

第二个突变是第7外显子的单碱基替换，即c.740A>G，它被认为是一个甘氨酸残基(p.Glu247Gly)取代谷氨酸残基。

这两个SNPs存在于7例患者的正常DNA中(即病例1/N ~ 7/N)，以及4/7例患者的肿瘤DNA中(即病例1/T ~ 4/T)。相反，在3/7例患者(即5/T至7/T病例)中，320位A核苷酸未缺失，且肿瘤DNA中缺失c.740A>G突变(表3)。

此外，所有患者的DNA存在常见的缺失o，261delg。

情况下数量	ab基因型	c.320delA	c.740A > G
1 / N.	O / O.	+	+
1 / T.	O / O.	+	+
2 / N	O / O.	+	+
2 / T	O / O.	+	+
3 / N	O / O.	+	+
3 / T	O / O.	+	+
4 / N	O / O.	+	+
4 / T	O / O.	+	+
5 / N	O / O.	+	+
5 / T	A / O.	-	-
6 / N	O / O.	+	+
6 / T	A / O.	-	-
7 / N.	O / O.	+	+
7 / T.	A / O.	-	-

表格3：突变外显子6和第7名患者中。
+:突变的存在;
- ：没有突变。

讨论

不相容的A抗原只存在于肿瘤中，而看起来正常的邻近乳腺组织没有标记抗A，也没有显示酶活性，证实不相容抗原表达与癌症有关，而不是与个体有关[21-24]。

4/7患者在正常和肿瘤中进行基因分型O / O，在肿瘤中正常和A / O中的3/7患者基因分型O / O.该结果与大卫L的研究不一致，表明表达抗原的所有病例是基因分型O / O，其常见缺失261delg [25]。

为了研究导致A抗原表达的可能突变，并回答A抗原来自非缺失O等位基因的假设，我们对ABO基因的最后两个外显子6和7进行了测序。对7例患者的正常和肿瘤DNA进行测序，发现261delG公社缺失和2个新突变，分别位于第6外显子的320位(c.320 delA)和740位(C.740 A>G)。

我们的结果表明，正常的DNA基因分型O / O在261,320和740中是杂合的。在261处缺少一个等位基因，第二个等位基因在320时缺少。由缺失320产生的止止封密码将产生甘糖基三转移酶的截止蛋白质活性A或B，因此正常组织仅表达抗原。然而，在表达抗原的肿瘤组织中，肿瘤DNA在261中杂合，而除去缺失320，产生的终止密码子不再存在，并且没有改变读数框架，因此合成糖基转移酶A（图1）。

图1：电光线显示正常DNA基因分型O / O（顶部）和肿瘤DNA基因分型A / O（下图）的一种情况（表明样品ID）。

相比之下，4/7例基因型O/O患者的肿瘤DNA有相同的缺失c.320 delA和c.740>g与肿瘤组织表达相应的不相容抗原A。通过分析H抗原在正常和肿瘤组织中的表达，我们在1/4例患者中观察到H抗原在肿瘤组织中保留了强烈的表达，80%的细胞表达了H抗原，而40%的细胞表达了不配伍的A抗原。在这种情况下，测序结果可能取决于样本组织中DNA的比例或数量。其余患者(3/4)肿瘤组织上未表达H抗原。另一种分子机制可能与不相容的A抗原有关。

在另一方面，MAAF-侯赛尼等。[26]表明，非缺失O基因经常出现，代表了血清学和基因分型的错误解释的严重风险，虽然他们是罕见的。同样的团队研究了献血表型为低凝集的一个案例和基因型A1 / O1。等位基因缺少常见的突变c.261delG以及呈现突变322C> T，创建该氨基酸107后立即终止密码子的O，已基因分型作为A1等位基因。该等位基因被认为是完全不能产生无活性的酶，但事实并非如此。事实上，一个终止密码子的存在并不一定意味着这种酶是无活性的（图2）。

图2：O型等位基因和a型等位基因突变的示意图模型。

已经提出了两个假设。可能是能够引发生物合成转移酶作为基因转化的另一种独立基因。此外，可以在骨髓或其外部的体细胞克隆中发生重组事件，并在同一人内引起双重群体[24,27]。

另外，我们没有观察到表达a样抗原的病例与其他病例在临床和病理特征上的显著差异。作者认为，不相容的A抗原表达可能是由于对非自身[28]血型抗原的抗体的自然产生而对癌细胞的排斥。

经典的例子是患有胃癌的小型血群患者，其肿瘤组织表达不相容的P抗原。Levine提出，由于输血P不相容，患者刺激了抗P，P2和PK的合成，因此对患者免受不相容的P抗原的免疫抑制[29]。

据调查，O型血生育O型血孩子的女性与O型血生育a型血[30]不相容孩子的女性相比，结直肠癌的发病率较高。O型腺癌患者的低发病率提供了一个证据，证明不相容抗原A的表达作为对癌细胞免疫监测的触发器的重要性。

我们的发现表明了相同的假设，因为抗原A存在于所有病例的细胞质中。人们已经认识到，在癌症中诱导免疫应答的大多数肿瘤抗原是内源性合成的胞质蛋白，并在胞质中降解为与主要组织相容性复合体1类相关的小肽[31,32]。

结论

我们的结果允许断定患者表示，相抵触的抗原与表O的在42.86％的情况下衍生自的等位基因缺失ø在通过类似于在外显子6中的A转移和7.尽管其知之甚少的功能和免疫反应性蛋白质的位置320在癌症的生物合成的生物功能，A抗原的肿瘤细胞的表面上表达可以使抗原临床肿瘤预后的生物标志物是有用的。如果表达A抗原的肿瘤被识别，并且可以通过免疫系统被抑制，那么它可能代表了免疫治疗一个有趣的潜在目标。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

致谢

我们非常感谢Pr S. ZAMIATI为我们进入病理科提供了便利。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Zouine S, Bakhchan A, Zaid N, Zaid Y, Kojok K, et al.(2016)非缺失的O参与乳腺癌中不相容的A表达。J Blood Disord Med 2(1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2471 - 5026.113

版权:©2016 Zouine S等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版历史记录：

收到日期:2016年11月2日

接受日期:2016年11月14日

发表日期:2016年11月18日