摘要

本研究的目的是评估半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸保护肝细胞免受扑热息痛毒性作用的比较效果，通过监测实验兔的肝功能参数。在本研究设计中，动物被分为两组;急性组和慢性组。每组进一步分为五个小组;对照组(组i)、毒性组(组ii)、半胱氨酸处理组(组iii)、赖氨酸处理组(组iv)、甘氨酸处理组(组v)。本研究表明，半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸能显著降低对乙酰氨基酚致肝毒性家兔肝酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，半胱氨酸和赖氨酸处理组与甘氨酸处理组相比，肝脏指标显著降低。因此，与甘氨酸相比，半胱氨酸和赖氨酸具有更好的临床应用价值。

关键字

对乙酰氨基酚；肝毒性；半胱氨酸；赖氨酸；甘氨酸

介绍

肝脏是一个既有分泌功能又有排泄功能的器官。肝脏的大部分合成和代谢功能由肝细胞完成。肝细胞在蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素和激素的代谢和储存中起着重要作用。血浆蛋白也由肝实质细胞合成。肝脏既可以合成蛋白质，也可以合成蛋白质将胆固醇从体内去除。需要时，非必需氨基酸也由肝脏合成[1,2]。

肝酶包括SGOT（血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶）、SGPT（血清谷氨酸丙酮酸转氨酶）、ALP（碱性磷酸酶）和LDH（乳酸脱氢酶）存在于肝细胞内。当肝细胞损伤或死亡时，这些酶在循环中释放。SGOT和SGPT的血浆半衰期分别为16-18小时和42-48小时，而线粒体SGOT的半衰期为87小时。这些酶作为肝损伤的标志物。胆红素是通过酶解血红蛋白在肝脏中形成的TICULO内皮系统。肝脏损伤时，血浆胆红素水平也升高[3]。

对乙酰氨基酚（N-乙酰对氨基苯酚，4-羟基乙酰苯胺），也称为对乙酰氨基酚，是常用的止痛药和解热药。在治疗剂量下，它是最安全有效的药物。当意外服用大剂量药物或企图自杀时，这种有毒剂量的对乙酰氨基酚会导致肝脏小叶中心坏死，导致肝衰竭，最终死亡[4,5]氧化应激、硝基酪氨酸形成、炎性细胞因子和线粒体通透性转换被认为与扑热息痛诱导的肝毒性有关。扑热息痛基本上通过与葡萄糖醛酸和硫酸盐结合代谢，但一个次要途径也是通过Cyp4502E1酶系转换扑热息痛amol转化为有毒代谢物N-乙酰基-对苯醌亚胺（NAPQI）。NAPQI通过谷胱甘肽（GSH）解毒通过形成谷胱甘肽结合物的途径。如果对乙酰氨基酚过量，会产生高浓度的NAPQI，从而导致GSH储存的消耗。因此，这种有毒代谢物与正常细胞蛋白质的–SH基团反应，形成对乙酰氨基酚蛋白质加合物，并导致细胞死亡[6,7]。

氨基酸具有多种保护作用，可以帮助身体对抗应激状态。它们大量存在于富含蛋白质的食物中，如家禽、鸡蛋、小麦、花椰菜、大蒜、洋葱、红辣椒、大豆和坚果。N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前体，用于预防扑热息痛诱导的肝毒性[8]。谷胱甘肽由三种氨基酸组成；甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸。L-半胱氨酸是一种非必需含硫氨基酸，可在人体内由氨基酸甲硫氨酸合成。在蛋白质营养不良或肝脏谷胱甘肽耗竭导致氧化应激的情况下，半胱氨酸可恢复γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶[9]。半胱氨酸是谷胱甘肽（GSH）的前体，具有强大的抗氧化性能，并作为细胞外还原剂[10]。赖氨酸也是一种必需氨基酸，可用于重金属螯合、蛋白酶激活、激素和抗体的产生，从而增强免疫系统[11]。甘氨酸是一种非必需氨基酸，因为在人体内，它可以由肝脏从其他氨基酸中产生。甘氨酸可以保护身体抵抗各种疾病，如败血症、出血和内毒素攻击。甘氨酸还保护肝脏、肾脏、骨骼肌和心脏免受缺血、寒冷条件下的再灌注损伤以及各种有毒化合物和药物[12]。

本研究的主要目的是确定不同氨基酸对扑热息痛致肝毒性动物的疗效。半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸在改善扑热息痛(最常用的镇痛和退热药物)引起的肝损伤方面的相对有效性进行了评估。

材料

化学物质

本实验使用了l -半胱氨酸(Daejung)、赖氨酸(Fluka Granite)和甘氨酸(Merck Pharmaceuticals)三种氨基酸，以检查它们的肝保护作用，而使用扑热息痛引起肝毒性。所用溶剂均为分析级。蒸馏水是从我们实验室的蒸馏计划中获得的。

实验动物

体重在1 - 2公斤的白化兔从当地市场购买。这些动物被饲养在拉合尔旁遮普大学药学院的动物屋里。在开始实验之前，他们已经适应了一星期的环境。兔子被喂食新鲜的绿色饲料和水随意。

收集的血液

兔子被放在一个木盒子里，兔子的耳朵被小心地剃掉了。通过摩擦耳朵，耳朵的边缘静脉变得突出。用锋利的外科手术刀进行精细的切割，然后在离心管中采集血液。采集的血液在冰水中保存10分钟，并以4000转/分钟的速度离心15分钟。最后用微量移液管在Eppendorf中收集血清并标记。

实验设计

实验兔主要分为两组;急性组和慢性组。每组又分为5个亚组，每个亚组6只兔子(n=6)进行实验研究。治疗前，对所有家兔进行物理生化检查，只选取健康家兔进行研究。

急性治疗组(ATG组)

各治疗亚组在给出各自治疗方案6小时后采血，观察肝功能指标SGPT、SGOT、ALP、LDH、总胆红素(TB)的变化。

第一组(对照组):该组通过胃管给予蒸馏水。

第二组（中毒组）：将3g/kg扑热息痛粉末溶于水中，以黄芩为悬浮剂制备扑热息痛混悬液，经胃管给家兔灌胃，诱导急性肝毒性。

III组(l -半胱氨酸治疗组):l -半胱氨酸600mg/kg腹腔注射10min后给予急性扑热氨中毒剂量。

第四组（赖氨酸治疗组）：l -赖氨酸(10mg/kg)腹腔注射10min后给予急性扑热氨醇中毒剂量。

第五组（甘氨酸治疗组）：甘氨酸(800mg/kg)经胃管灌胃10min后给予急性中毒性扑热氨醇。

慢性治疗组

在该研究组中，每个亚组按照各自的方案治疗30天，然后抽取血样，观察肝功能试验（LFT）参数（ALT、AST、ALP、LDH和总胆红素）的变化。

第一组(对照组):该组通过胃管口服安慰剂（水）30天。

第二组（中毒组）：对乙酰氨基酚悬浮剂是将75mg/kg/d对乙酰氨基酚粉溶于水中，以黄芪多糖为悬浮剂制备的对乙酰氨基酚悬浮剂，经胃管灌胃给兔30 d，肝功能正常。

III组(l -半胱氨酸治疗组):l -半胱氨酸(200mg/kg)腹腔注射对乙酰氨基酚治疗的兔子在其30天的毒性方案的最后一周。

第四组（赖氨酸治疗组）：l -赖氨酸(3mg/kg)腹腔注射给对乙酰氨基酚治疗的兔子在其30天的毒性方案的最后一周。

第五组（甘氨酸治疗组）：甘氨酸(266.6mg/kg)通过胃管口服给药对乙酰氨基酚治疗的兔子在其30天的毒性方案的最后一周。

统计分析

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。所有肝脏剖面参数均以平均值的标准差表示。采用方差分析(ANOVA)后置杜克氏检验(post-hoc tukey’s test)，采用SPSS统计工具对不同实验组进行比较^®版本21。统计学值p≤0.05被认为是显著的。

结果

对乙酰氨基酚、l -半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对急性治疗研究中肝脏形态的影响

在急性毒性研究中，观察了对乙酰氨基酚的毒性作用以及l -半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸三种氨基酸对SGOT、SGPT、ALP、LDH和总胆红素水平的保护作用(表1，图1A)。中毒性组(II组)与对照组(1组)比较，中毒性组SGOT(84%↑)、SGPT(70%↑)、ALP(22%↑)、LDH(80%↑)、总胆红素(57%↑)水平显著升高(p<0.05)。半胱氨酸处理组(III组)与毒性组(II组)比较，血浆SGOT(60%↓)、SGPT(41%↓)、ALP(63%↓)、LDH(73%↓)和总胆红素(59%↓)水平显著降低(p<0.05)。赖氨酸处理组(IV组)血浆SGOT(30%↓)、SGPT(61%↓)、ALP(49%↓)、LDH(73%↓)和总胆红素(57%↓)水平较中毒组(II组)显著降低(p<0.05)。甘氨酸处理组(V组)SGOT(18%↓)水平无显著变化(p>0.05)，而SGPT(33%↓)、ALP(26%↓)、LDH(66%↓)和总胆红素(46%↓)水平显著降低(p<0.05)。

慢性毒性研究中对乙酰氨基酚、L-半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对肝脏形态的影响

在慢性毒性研究中，观察到对乙酰氨基酚的毒性作用以及三种氨基酸（包括L-半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸）对SGOT、SGPT、ALP、LDH和总胆红素水平的保护作用（表2，图1B）。在毒性对照组（II组）和对照组（1组）之间应用统计工具后，SGOT水平显著增加（p<0.05）（64%↑), 新加坡元（103%↑), 碱性磷酸酶（15%↑), 乳酸脱氢酶（23%↑) 和总胆红素（33%↑) 半胱氨酸治疗组（III组）与对照组（II组）相比，血浆SGOT水平显著降低（p<0.05）（25%↓), 新加坡元（29%↓), 碱性磷酸酶（19%↓), 乳酸脱氢酶（28%↓) 和总胆红素（20%↓). 同样，赖氨酸处理组（IV组）的血浆SGOT水平显著降低（p<0.05）（21%↓), 新加坡元（25%↓), 碱性磷酸酶（12%↓) LDH水平无显著变化（23%↓) 和总胆红素（17%↓) 与阳性对照组（第二组）相比，甘氨酸治疗组（第五组）的SGOT（18%）无任何显著变化（p>0.05）↓) 乳酸脱氢酶水平（19%↓) 和总胆红素（16%↓) 而SGPT水平显著下降（p<0.05）（25%↓), 碱性磷酸酶（15%↓).

表1:l-半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸对扑热息痛治疗兔急性肝谱的影响
1.I组:对照组，II组:毒性组，III组:半胱氨酸治疗组，IV组:赖氨酸治疗组，V组:甘氨酸治疗组
2.数值表示为Mean±SEM
3.*表示P<0.05
4.第一组与第二组进行比较。第二组与第三、四、五组进行比较

表2：l-半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸对扑热息痛治疗家兔sgot水平的影响
1.第一组：对照组，第二组：中毒组，第三组：半胱氨酸治疗组，第四组：赖氨酸治疗组，第五组：甘氨酸治疗组
2.数值表示为Mean±SEM
3.*表示P<0.05
4.第一组与第二组进行比较。第二组与第三、四、五组进行比较

图1:急性研究中半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对扑热息痛诱发肝毒性的肝脏影响的比较

图1B：对乙酰氨基酚肝毒性慢性研究中半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对肝参数的比较作用。

表3：急性和慢性研究中治疗组的多重比较
1.第一组：对照组，第二组：中毒组，第三组：半胱氨酸治疗组，第四组：赖氨酸治疗组，第五组：甘氨酸治疗组
*表示P<0.05

讨论

药物性肝损伤（DILI）是药物治疗的主要限制因素。这是肝脏最常见的疾病[13]。肝毒素有一个独特的途径，通过它可以损伤肝细胞。个体因素在使患者易受药物性肝损伤（DILI）的影响方面也起着关键作用。通过毒理基因组学和蛋白质组学的进步了解这些因素，可以将损害降至最低[14]。许多药物已经上市，以防止药物引起的肝毒性。其中，氨基酸在防止细胞损伤中起着核心作用。在这项研究中，观察了半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对抗肝毒素的比较有效性。

在表3中，比较研究表明，半胱氨酸和赖氨酸都是同样有效的，取决于以下提示的途径，但甘氨酸在降低SGOT水平上不是同样有效的，但甘氨酸在肝脏炎症病理条件中发挥重要作用。在急性和慢性毒性研究中，半胱氨酸治疗组(III组)SGPT、SGOT、ALP、LDH和胆红素水平均显著降低(P<0.05)。半胱氨酸是谷胱甘肽和pps(3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸盐)合成所必需的。paracetamol的硫酸酯化需要PAPS, NAPQI的解毒需要谷胱甘肽。因此，半胱氨酸通过将扑热息痛代谢转向更安全的侧[15]来预防扑热息痛引起的肝毒性。谷胱甘肽通过还原活性氧具有抗氧化性能。半胱氨酸还通过增加γ谷氨酰基半胱氨酸连接酶的水平，使机体从氧化应激中恢复过来，这种酶是合成谷胱甘肽[9]所必需的。赖氨酸处理组(iv组)SGOT和LDH水平也有类似的显著降低，SGPT水平极显著降低，ALP水平极显著降低。L-N⁶-(1-亚氨基乙基)-赖氨酸(L-NIL)是赖氨酸的衍生物。也有人认为L-NIL作用于iNOS酶的活性位点，抑制其活性。L-NIL通过灭活NF-B来抑制iNOS mRNA的表达，NF-B调控iNOS mRNA的表达。L-NIL还通过减少肝脏中NO的产生来维持谷胱甘肽水平，因为活性氮被谷胱甘肽[16]清除。它还能恢复窦房结的灌注。L-NIL还通过降低对乙酰氨基酚[17]的生物活性来防止肝损伤。

甘氨酸治疗组(V组)的结果略有不同(表3)和(图1)。在急性和慢性研究中，只有SGPT水平显著降低。甘氨酸是谷胱甘肽(GSH)的一部分，是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的三肽，保护细胞免受自由基相关的氧化应激[18]。甘氨酸也能提高大鼠肝移植的存活率。甘氨酸可预防肝毒性药物[20]中毒引起的吞噬、肝细胞损伤、纤维化和凋亡。甘氨酸还具有抗过氧化作用，可恢复超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，从而保护细胞免受NAPQI的氧化应激。甘氨酸还能维持肝[1]的脂质过氧化(LPO)水平。本研究还证实了甘氨酸在维持肝脏抗氧化活性方面的作用。在扑热息痛诱导的肝毒性中，库普弗细胞被激活，导致细胞因子的释放。甘氨酸门控氯通道位于库普弗细胞上。因此，细胞因子的产生被抑制，因为甘氨酸通过超极化细胞膜使库普弗细胞失活。 So glycine possesses anti-inflammatory activity and improves hepatic pathologic conditions [21]. Glycine also increases portal blood flow, production of bile, the hepatic microcirculation which improves cytochrome P450 activity and significantly reduces the levels of ALT,AST during hepatocellular injury [22].

结论

推测半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸可显著降低对乙酰氨基酚致肝毒性家兔肝酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，与甘氨酸处理的动物相比，半胱氨酸和赖氨酸处理组的肝酶显著降低。

利益冲突

声明不存在利益冲突。

参考文献

1. 甘氨酸对酒精性肝损伤大鼠抗氧化防御系统的影响。国际药物生物医学杂志2:1314-1320。［裁判。]
2. Sembulingam K，Sembulingam，Prema（2012）医学生理学要点：JP医疗有限公司。
3. Renner EL（1995）肝功能测试。Baillière的临床胃肠病学9:661-677[裁判。]
4. cigreis Y, Turel H, Adiguzel K, Akgoz M, Kart A(2009)急性对乙酰氨基酚毒性对家兔肝脏SOD、CAT、GSH-Px mRNA表达及过氧亚硝酸盐、一氧化氮、还原性谷胱甘肽、丙二醛水平的影响。生物谷Biochem 23: 31-38。［裁判。]
5. Prescott LF(1980)对乙酰氨基酚和非那西丁的动力学和代谢。临床药理学杂志。10:291S-298S。［裁判。]
6. Frank J. Gonzalez (2007) cyp2e1。药物代谢和处置35:1-8。［裁判。]
7. James LP，Mayeux PR，Hinson JA（2003）醋氨酚诱导的肝毒性。药物代谢处置31:1499-1506[裁判。]
8. (2014) 48小时静脉注射n -乙酰半胱氨酸治疗对乙酰氨基酚中毒的单组临床试验。中国Toxicol(费拉)。52: 512 - 518。［裁判。]
9. Atmaca G(2004)含硫氨基酸的抗氧化作用。延世医院J 45: 776-788。［裁判。]
10. 硫和硒的抗氧化活性:清除活性氧、谷胱甘肽过氧化物酶和金属结合抗氧化机制的综述。细胞生物化学55:1-23。［裁判。]
11. Vasal SK(2004)高赖氨酸谷物在亚洲动物和人类营养中的作用。在动物饲料工业的蛋白质来源上发表的论文。粮农组织专家协商和讲习班，泰国曼谷。
12. Zhong Z, Wheeler MD, Li X, Froh M, Schemmer P, et al. (2003) l -甘氨酸:一种新型的抗炎、免疫调节和细胞保护剂。6: 229-240。［裁判。]
13. Grant LM，Rockey DC（2012）《药物诱导的肝损伤》。Curr Opin Gastroenterol。28:198-202[裁判。]
14. kapplowitz N(2004)药物性肝损伤。临床感染Dis 38: S44-S48。［裁判。]
15. Price VF, Jollow DJ(1989)缺乏硫氨基酸饲料对大鼠对乙酰氨基酚代谢和肝毒性的影响。毒理学应用药物101:356-369。［裁判。]
16. Knight TR, Ho YS, Farhood A, Jaeschke H(2002)过氧亚硝酸盐是小鼠肝脏对乙酰氨基酚毒性的关键介质:谷胱甘肽的保护。J Pharmacol Exp Ther 303: 468-475。［裁判。]
17. (1)一氧化氮对乙酰氨基酚致小鼠肝微血管损伤的影响。Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 286: G60-G67。［裁判。]
18. Senthilkumar R, Sengottuvelan M, Nalini N(2004)补充甘氨酸对酒精性肝损伤大鼠红细胞脂质过氧化和抗氧化酶水平的保护作用。细胞生物学功能22:123-128。［裁判。]
19. Schemmer P, Bradford BU, Rose ML, Bunzendahl H, Raleigh JA, et al.(1999)静脉注射甘氨酸可提高大鼠肝移植存活率。Am J Physiol. 276: G924-G932。［裁判。]
20. (in chinese)[吴红伟，恽昆明，韩德伟，徐瑞林，赵永昌(2012)甘氨酸对库普弗细胞体外吞噬和分泌的影响。]世界胃肠病学杂志18:2576-2581。［裁判。]
21. 惠勒医学博士，Ikejema K，Enomoto N，Stacklewitz RF，Seabra V等（1999）甘氨酸：一种新的抗炎免疫营养素。细胞生命科学。56(9-10): 843-856. [裁判。]
22. Sheth H，Hafez T，Glantzounis GK，Seifalian AM，Fuller B等。（2011）甘氨酸在热肝缺血再灌注损伤后维持线粒体活性和胆汁成分。胃肠病学肝脏杂志26:194-200[裁判。]

在此处下载临时PDF

条信息

文章类型:研究文章

引用:Ahmad M, Javaid A, Kamran SH, Anwar R, Saleem Z，等。药物研究进展2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-1009.112

版权:©2016 Ahmad M，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版历史：

收到日期:2015年12月07

接受日期:2016年1月18日

发表日期:2016年1月21日