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物品类型：研究文章

引用：Svetlov SI, Prima V, Zhang Z, Curley KC, Kobeissy F, et al.(2015)与机械性脑损伤相比，爆炸暴露后大鼠中脑急性和亚急性差异基因表达。J Neurol Neurobiol，第1.1卷:http://dx.doi.org/10.16966/2379-7150.103

版权:©2015 Svetlov SI等。这是一篇开放存取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2月25日,2015年。

接受日期：03年3月,2015年。

发表日期:07年3月,2015年。

摘要

在本研究中，我们采用两种大鼠创伤性脑损伤(TBI)模型:头部定向爆炸超压暴露(OBI)和机械控制皮质撞击(CCI)。两组动物作为对照:naïve大鼠和暴露在爆炸噪声下的大鼠。采用基因组学神经系统生物学方法分析实验组之间的差异基因表达。创伤后24小时(急性期)和7天(亚急性期)分离中脑RNA，用含有31100个基因序列的Affymetrix序列探针检测，并由安捷伦技术进行量化。将差异表达基因分成功能簇，并使用参数和非参数t检验(Welch校正)进一步评估基因在24 h和7 d表达变化的显著性。然后，利用神经系统生物学工具创建和分析了爆炸暴露和机械冲击后病理路径中的基因相互作用。

根据方差分析（p<0.05），爆炸暴露组（与对照组相比）中994个基因的表达存在显著差异，CCI组（与对照组相比）中1532个基因的表达存在显著差异整体重叠579个基因。参数和非参数t检验显示，与CCI相比，爆震暴露动物在24小时和7天时各种基因变化的时间分布存在显著差异。具体而言，参与神经发育和修复的基因，如ROBO1和NEDD4，在CCI中上调，而在e在爆炸暴露后显示为下调。

这些结果表明，在这两种大脑损伤之间，基因表达存在一些差异和重叠。这将有助于揭示每个脑损伤的特定分子特征，并有助于发展慢性创伤后脑病的诊断。

关键字

爆炸脑损伤;控制大脑皮层的影响;基因表达;Neurorepair;基因组学;神经系统生物学

介绍

尽管在了解创伤性脑损伤(TBI)，特别是战斗相关的TBI方面取得了显著的进展，但不同的病理途径和长期结果仍有待揭示和描述。具体来说，需要解决的问题是，爆炸引起的创伤性脑损伤的机制在多大程度上与包括脑震荡在内的机械冲击型脑损伤相似，以及可能有什么不同。尤其重要的是阐明不同水平的分子调控的分子动力学变化;这将包括基因表达研究(mRNA)及其调控(miRNA)，蛋白质组学及其相关领域的代谢组学。

我们实验室和其他人已经进行了一些研究，以建立创伤性脑损伤的病理综合图像，包括基因组和蛋白质组特征[2-4]。然而，有报告显示，与机械损伤(如控制性皮质撞击(CCI)或闭合性头部损伤)相比，爆炸暴露后发生的基因组变化进行了并排分析。此外，使用神经系统生物学工具来揭示和可视化基因相互作用、分子功能和涉及这种脑损伤的生物过程，以及破译非穿透性爆炸损伤和机械CCI损伤背后的路径重叠或差异，似乎是至关重要的。

本研究的主要目的是应用先进的基因组学和神经系统生物学工具，比较在挑战后不同时间内，由机械控制皮质撞击(CCI)造成的中度爆炸暴露合并脑损伤的改变基因表达模式。为此，采用包括分子功能和生物学过程在内的基因本体论分析方法对差异基因进行鉴定;此外，基因相互作用的一个全局方法是看基因是如何相关的，以及识别由于这种相互作用涉及的下游靶标的靶向方法。这使我们能够揭示blast和CCI脑损伤之间依赖于时间的相似性和损伤特异性的差异，并揭示神经炎症、神经介质和神经修复成分的关键成分。

材料和方法

动物暴露于受控爆发波：模拟爆炸超压暴露是通过目标与爆炸发生器的可变定位来实现的，在前面的[5]中有详细描述。利用PCB压电式爆破压力传感器和LabView 8.2软件获取爆破压力数据。成年雄性大鼠(Sprague-Dawley, Harlan, Indianapolis, IN, USA)在1:1 O2/N2O (4min)[5]载气中用4%异氟醚麻醉。在到达麻醉深度后，将它们放入暴露在休克管出口喷嘴下方5cm处的支架中。大鼠被直接放置在激波管上。让他们暴露在“复合”爆炸中，包括峰值超压为52 psi的压缩空气喷射，持续时间为10毫秒。对照组麻醉后，将动物置于避震管旁的笼子中，产生冲击波，使动物仅暴露于噪声中。

控制性皮质冲击(CCI)

采用控制性皮质撞击(CCI)程序对大鼠进行机械性脑外伤模型，基本如前所述[6]。简单地说，用4%异氟醚麻醉大鼠，用2.5%异氟醚维持麻醉。持续监测核心体温，维持在37±1℃。动物以俯卧位固定在立体框架中，并用耳朵和门牙棒固定。在正中颅切口和软组织反射后，在正中缝线(bregma和lambda中间)附近进行单侧(撞击部位同侧)开颅术。皮质上的硬脑膜完好无损。以3.5 m/s的速度，用直径为4 mm的撞击器或附在电磁驱动器上的尖端撞击右侧(同侧)皮层，压缩2.5 mm，停留时间200 ms。

为了预防疼痛和不适，并确保遵守佛罗里达大学制定的指导方针，对BLAST和CCI进行适当的创伤前后管理。机构动物护理和使用委员会和美国国立卫生研究院的指导方针详见《实验动物护理和使用指南》。此外，研究是根据《动物福利法》和其他与动物和涉及动物的实验有关的联邦法规和条例进行的，并遵守“实验德赢vwin首页网址动物护理和使用指南，NRC出版物，1996年版”中规定的原则

脑组织采集：在创伤后24小时或7天，对动物实施安乐死;按照方案，用brain Slicer装置从中脑区(4-5 mm厚)解剖脑组织(图1)。在切面中部(Bregma后约-5 mm至-9 mm)清除周围皮层、垂体等组织。它被切成两半，快速冷冻用于蛋白质组学(L)，或保存在RNALater (Ambion, Austin, TX)中用于RNA研究。

确保RNA分离、质量表征和验证(安捷伦生物分析仪，圣克拉拉，CA)，并根据QC/QA指导程序，在阿萨朗根公司(奥斯汀，德克萨斯州)使用affmetrix基因芯片进行基因组分析。采用Affymetrix GCOS v1.3杂交和阵列扫描后收集原始荧光数据。数据进一步归一化并使用Affymetrix MAS 5.0算法计算。采用单因素方差分析对汇总值进行分析，配对naïve、噪声控制和创伤性脑损伤组之间的差异进一步通过参数和非参数t检验与Welch校正(GraphPad, Inc.)确定。路径图是使用系统生物学软件PathwayStudio (Ariadne Genomics, Rockville, MD)创建的。其他分析软件:Partek Genomic Solutions 6.2 (Partek Inc.， St. Charles, MO);Matlab 7 (Mathworks Inc.， MA)。

神经系统生物学分析

CCI基因微阵列差异表达，使用生物信息学系统生物学方法对爆炸损伤队列与各自的对照进行进一步分析，以评估与差异特异性脑损伤改变基因相关的改变途径及其对CCI和/或爆炸损伤发展的贡献。PathwayStudio软件(v 10;Ariadne Genomics, Rockville, MD, USA)用于神经系统生物学分析。该软件有助于从差异基因表达解释生物学意义，构建和分析途径，并识别改变的细胞过程和分子功能涉及。

结果与讨论

经方差分析(p<0.05)， blast暴露组994个基因与对照组相比表达差异显著，CCI组1532个基因与对照组相比表达差异显著，总体重叠基因579个。参数和非参数t检验显示，与CCI相比，暴露于爆炸的动物在24小时和7天内各种基因变化的时间廓线有显著差异。此外，与未接触噪声的大鼠相比，暴露于噪声的大鼠的一些基因表达发生了变化。

已有多项研究评估机械损伤后啮齿类动物大脑的基因表达变化，包括CCI和流体冲击损伤(FPI)，主要是皮质和海马组织[3,7-10]。在啮齿动物中，blast后基因表达的信息较少。在最近的一项大鼠研究中，使用有限的基因阵列评估了[11]爆炸后24小时内的海马和前额叶皮层的变化。Risling和同事们研究了在有和没有头部加速和脑穿透损伤的大鼠中，母细胞诱导的TBI的机制，包括24小时海马基因组的改变，也强调了神经炎症、细胞死亡和突触传递[12]。然而，他们注意到一个重要的基因下调涉及神经发生和突触传递。在小鼠中，比较爆炸和机械损伤后海马的行为变化和伴随的某些基因表达，然后通过Q-PCR[13]进行验证。

在我们的研究中，我们使用了blast TBI模型，并使用Assuragen公司提供的全尺寸affmetrics基因芯片(31100序列)阵列，比较了挑战后24小时和7天CCI对大鼠中脑的基因组变化。此外，我们分析了显著改变的基因(ANOVA p<0.05)，并将它们分为主要功能簇/组，(a)全身/血管反应;神经炎症;蛋白水解作用;(b) neuromediators;信号;离子通道;(c)神经发育/修复;在爆炸和CCI组中，在24小时和7天与各自的对照，以及在某些情况下，CCI控制与爆炸噪声控制，使用t检验评估显著性。最后，利用系统生物学工具绘制和描述了blast和CCI后的基因相互作用。 Pathways reflecting gene-associated molecular functions altered after blast injury were created and compared to CCI.

全身/血管反应，神经炎症，蛋白质水解

在blast和CCI组中，包括急性期激肽原1、组织蛋白酶和趋化因子在内的几个蛋白水解和炎症基因均有显著变化(表1A和2A)。然而，在这些反应中，blast和CCI组之间存在着重要的差异。首先，在CCI影响后24 h和7 d，一些趋化因子显著上调，而只有C-X-C配体1 mRNA表达在blast后24 h轻微上调，然后在blast后7 d下调。其次，TNF超家族成员11的表达在blast暴露后的所有时间都高度增加，但在CCI后没有变化。相比之下，MMP-9基因在CCI后的整个影响期都是上调的，但在最初的24小时轻微上调后，在第7天轻微下调(表1A和2A)。

blast组和CCI组都有几种常见的调节器和途径，如激动素原1（KNG1）连接炎症和止血、细胞因子和下游NF-kB（图1和图2）。这种差异反映在CCI中雌激素受体2、血氧合酶和几种趋化因子网络的参与（图2），而CD69、C-反应蛋白和急性期细胞因子以及血管收缩剂内皮素基因是blast暴露的主要特征上调途径（图1）。如上所述，编码肿瘤坏死因子（TNFSF11）和金属蛋白酶（MMP-9）的基因的不同方向和时间变化过程已被揭示。

编码细胞因子和趋化因子的基因(IL- 1, IL-6, C-X-C-L10)的早期上调已在最近的几项研究中得到证实，包括CCI和blast后海马和皮层的基因表达谱[7,11,14,15]。除促炎分子外，已有多篇报道显示抗炎IL-10和金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP-1)上调[11,12]。在本文中，我们展示了blast和CCI反应的重要差异，这可能对不同成因的TBI具有诊断/预后意义，以及更重要的治疗策略。

表1：blast暴露后中脑差异表达的mRNA。使用affemtrix芯片将RNA样本与荧光标记探针进行三次杂交，并使用配备软件的安捷伦技术扫描仪进行分析(详情见材料和方法)。将mrna按功能分组，并给出了最重要基因表达的时间进程差异。动物组中至少3只大鼠的背景校正和内控归一化荧光值均为Mean+ SEM，每个大鼠标本重复处理。

表2：CCI后中脑中选定mRNA表达的时间历程

使用affemtrix芯片将RNA样本与荧光标记探针进行三次杂交，并使用配备软件的安捷伦技术扫描仪进行分析(详情见材料和方法)。将mrna按功能分组，并给出了最重要基因表达的时间进程差异。动物组中至少有3只大鼠，每个大鼠标本重复处理，背景校正和内控归一化荧光值均为Mean+ SEM。

Neuromediators;信号;离子通道:该基因表达的一个非常重要的特征是，CCI后，S100钙结合蛋白A11 (calizzarin)、S100钙结合蛋白A8 (calgranulin A)和S100钙结合蛋白A4显著上调，而blast后则没有上调(表2B)。与噪声对照相比，爆炸暴露组大鼠GABA A受体pi基因明显上调(表1B)。CCI组与对照组相比，该基因表达有适度但不显著的增加(p=0.23)(表2B)。同样，与对照组相比，爆炸暴露组的谷氨酸离子性n -甲基-天冬氨酸受体显著上调，但CCI处理组的大鼠没有上调(表1B和2B)。与S100A家族CCI后的差异基因相互作用分别如图1和图2所示。

图1:爆炸脑损伤后基因相互作用的系统生物学图谱

在帧中显示了blast和CCI组中不重叠的路径关键组件。CASP9-caspase 9;CRP- C反应蛋白;IL1R2-白细胞介素1受体2型;esr2 -雌激素受体2型;血红素加氧酶1;cxl1趋化因子配体1;趋化因子受体CXCR2。KNG1 -激肽原1;TNFSF11-肿瘤坏死因子超家族成员11 Please see text for a detailed description. The upregulated genes are shown in red and downregulated genes are in blue. Yellow highlights indicate biphasic gene regulation (see table),

S100蛋白家族在TBI中的作用已经得到证实，作为Ca2+/calmodulin信号转导成分的S100B胶质蛋白在TBI中的作用也得到了广泛的研究，包括其临床诊断价值[16-18]。然而，S100在大多数机械性创伤模型(CCI、闭合性头部损伤、FPI)和TBI患者中的意义已被评估，而没有注意到其他成分。我们的数据强调了几个S100家族基因的参与，包括钙粒蛋白A和calizzarin的机械性皮质撞击发病机制，并显示了少量(如果有的话)S100在爆炸暴露后的损伤。重要的是，我们的数据显示谷氨酸离子受体基因2A(24小时和7天)和3B(24小时)在噪声控制中上调，这在爆炸暴露中未见报道(表1B)。

生长因子/神经发育/维修。在参与神经发育和修复的基因中，暴露组之间存在显著差异。与对照组相比，blast暴露后激活素受体样激酶7(神经元表达)基因显著上调，但cci受检组未见上调。与achaette -鳞片复合体同源物1和SRY-box包含基因11相比，在blast暴露后增加，但CCI与naïve对照没有变化甚至下调(表1C和2C)。

重要的是，与未成年大鼠相比，blast后表达发育下调基因4A（Nedd4a）的神经前体细胞的表达显著降低，但没有改变，CCI后甚至轻微（但不显著）增加。二氢嘧啶酶样3（CRMP-4）与blast组和CCI组各自的对照组相比，其表达下调。

环状轴突引导受体1 (Robo1)基因的表达模式最为有趣。CCI后显著上调，爆炸暴露后明显下调(表1C和2C)。

blast暴露触发GM-CSF和下游转录激活因子的激活，包括SOX11导致以微管蛋白为例的修复过程的诱导，如图1和2所示。WNT(负性)和RPS6K核糖体蛋白激酶基因以及tgf β相关通路，包括上调ALK7 (ACVR1C)/ SMAD转录调控因子。

相关的基因的分子功能

blast和CCI的分子相互作用途径如图3所示。综上所述，S100A家族基因在CCI队列中表达上调，并参与泛素、蛋白酶激活受体、Rho、GPCR、JAK信号转导的下游调控。在胚芽诱导组中，功能性调控途径显示了谷氨酸受体、CAMK和钙调素信号通路的潜在NCAM1依赖过程，和GABA/GABA A受体激活(表1B和图3)。使用该群集组件生成的病理/疾病图在blast和CCI组非常相似，并与群集1(全身/血管/神经炎症/蛋白质水解)重叠。虽然涉及一些不同的组件- S100A用于CCI和NCAM用于爆破(表2B和图3和4)。

图2:机械控制皮质撞击后的基因相互作用途径。符号/交互和非重叠组件如图2所示。ncam1 -神经细胞粘附分子1;GRIN3BKCNQ1-电压门控钾通道;grin3b -谷氨酸受体n -甲基- d -天冬氨酸3B;GRIN2A-谷氨酸受体n -甲基- d -天冬氨酸2A;P2RX2-嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道2;GABA-gamma aminobutiric酸;S100Acalcium结合蛋白;PLAUR-纤溶酶原激活剂，尿激酶受体。 Please see text for details.

图3:与爆炸损伤有关的基因相关分子功能:分子组成和相关病理的系统生物学图谱。符号和交互与图2中相同。FGFR2-成纤维细胞生长因子受体2;CSF2-粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;IGF1R-胰岛素生长因子1受体;ACVR1C-激活素受体样激酶7;ROBO1-环状轴突引导受体1;nedd4 -神经前体细胞表达发育下调基因4;DPYSL3-dihydropyrimidinaselike 3 (CRMP-4)。详细描述和讨论请参阅正文。

图4:与CCI损伤相关的基因通路和分子功能:符号和相互作用如图2所示。fgfr2成纤维细胞生长因子受体2;CSF2-粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子;IGF1R-胰岛素生长因子1受体;ACVR1Cactivin receptor-like kinase 7;ROBO1-环状轴突引导受体1;nedd4 -神经前体细胞表达发育下调基因4;DPYSL3-dihydropyrimidinase-like 3 (CRMP-4)。详细描述和讨论请参阅正文。

涉及神经修复的基因和分子过程尚不清楚，因此阐明损伤后结局的机制、分子成分和生物标志物将具有巨大的临床意义。具有下游MAP激酶家族的FGF通路与爆炸暴露后的基因调控负相关（表1C，图1）。CCI后，中脑基因调控的中心点似乎是IGF1和EGF家族分子，包括IGF1受体和EGF配体基因，它们与blast效应基因（如微管蛋白、S6激酶、组蛋白和WNT）连接，如表2C和图2和图4所示。

功能角色ROBO1和NEDD4中枢神经系统目前还不清楚,但似乎从地图上下调ROBO1和NEDD4基因可以促进PI3激酶和RAS和刺激修复(图3和图4),而上调ROBO1和NEDD4 CCI后可以负面影响神经修复。

研究表明，ROBO1调节发育皮层[19]的神经发生。ROBO1通过neuropilin- 2[20]参与多巴胺能神经元的轴突引导，我们之前已经显示了[21]的上调。然而，blast后ROBO1的调控与CCI相反，这可能反映了ROBO1在前脑和新皮层表达和功能的空间特异性[22-24]，中脑blast波对ROBO1的影响与直接对皮层CCI的影响是不同的。然而，ROBO1及其相关狭缝系统在脑外伤后修复中的作用尚未被研究。此外，激活素受体家族(包括ALK激酶)在TBI后的作用尚未被研究，尽管ALK1信号使TBI诱导的GFAP mRNA水平降低，表明星形胶质和神经元对损伤[25]的反应减弱。

与噪声控制相比，ACVR1C显着上调，而与幼稚大鼠相比，CCI值并未同等地增加。与Robo1类似，在爆炸后，NEDD4A在中脑中下调，但在CCI后7天进行上调。显示NEDD4（WW）在皮质损伤后在存活的神经元中表达[26]，中脑中这些基因的差异表达可能反映空间差异。我们的数据一起揭示了ALK7，ROBO1和NEDD4首次参与爆炸后和后CCI，可能是脑修复。在最近的一篇论文中，海因尔曼和同事报告说，对来自患有后综合征患者收集的外周血（如EGFR接收器和Tensin-1）下调若干生长因子和受体基因的下调[27]。涉及这些重要组成部分在TBI仍有待调查后的神经损伤和恢复的特定机制。

结论

据所知，这是第一个基因组学研究，并排评估两种明确和特征明确的脑损伤中基因表达的改变——通过爆炸超压建模的TBI vs . CCI开放性头部损伤。为此，利用基于系统生物学的大鼠中脑转录组学分析进行了一项综合研究，比较了爆炸暴露和机械皮质冲击脑损伤。我们的数据显示，这些组之间的基因表达变化存在重叠和显著的时间依赖性差异，特别是在神经发育和修复的基因中。与CCI相比，blast诱导的TBI后，新成分，如ROBO1和NEDD4已被证明以相反的方式表达，这表明神经修复动力学可能涉及不同的机制。结果表明，需要进一步深入的研究来阐明爆炸和机械冲击造成的脑损伤的机制差异。这将有助于揭示潜在的生物标志物，并发展慢性创伤后脑病的诊断。

确认

作者谨感谢奥莱娜·格鲁沙科娃出色的技术援助。这项工作得到了美国国防部W81XWH-8-1-0376和W81XWH-07-01-0701的资助。这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以被解释为潜在的利益冲突。K.W.W.和S.I.S是Banyan生物标记公司的股东，该公司对商业化创伤性脑损伤诊断测试感兴趣。

要求免责声明:

本文所表达的观点和意见仅为作者个人观点，并不反映国防部或美国政府的官方政策或立场。

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