摘要

甲氧西林耐药和易感金黄色葡萄球菌(MRSA和MSSA)作为人类病原体仍然是一个公共卫生问题。研究了河流和城市污水中MRSA和MSSA的存在情况金黄色葡萄球菌种群的遗传多样性和优势基因型在各生态位上的分布。城市污水中MRSA比例高于河流(P<0.05)。根据spa类型的Simpson’s多样性指数，MSSA菌株的多样性高于MRSA菌株(P<0.05)。在MSSA河流分离物中检测到的主要温泉类型和STs与在城市污水中发现的不同。在MRSA人群中，ST125-t067是城市污水(67.6%)和河水(82.4%)的主要基因型。总体而言，在河水和城市污水中发现最多的MSSA和MRSA系是人类相关克隆(ST125-t067, ST5-t002;ST22-t032、ST30-t012和ST15-t084)。这些结果表明，水在金黄色葡萄球菌的维持和传播中具有潜在的作用。河流中分离菌与人类分离菌的关联可能反映了人类活动对生态系统的影响，这突出了评估病原体通过水在环境中的循环的必要性。

关键字

金黄色葡萄球菌;城市废水;河水;Spa打字;MLST

介绍

甲氧西林耐药和易感金黄色葡萄球菌(MRSA和MSSA)作为人类病原体[1]仍然是一个公共卫生问题。不同的遗传谱系被描述为医院相关mrsa (HA-MRSA)、社区相关mrsa (CA-MRSA)和牲畜相关mrsa (LA-MRSA)。由HAMRSA菌株引起的感染通常与住院、手术或留置医疗器械[2]等危险因素有关。CA-MRSA对健康人也有影响，其感染与毒素Panton-Valentine杀白细胞素或PVL[2]有关。最后，LA-MRSA被认为是一种职业风险，尽管在MRSA[3]流行率较低的国家，其隔离频率正在增加。由于HA-MRSA在社区和社区的发病率，这些群体之间的遗传分化变得越来越复杂反之亦然由于MRSA在人和动物之间的传播[4]。指出直接接触是最可行的传播途径金黄色葡萄球菌［3].然而，被殖民的个体可能会将细菌排放到城市污水和娱乐用水中[5,6]。污水处理厂被描述为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的蓄水池，并假设，参与其通过污水处理厂废水的传播，作为金黄色葡萄球菌污水处理可能使种群存活[6-9]。此外，MRSA在河水[10]中的存在指出了水在MRSA传播并进而传播到相关环境中的潜在作用[8,9,11]。这些事实促使我们研究城市污水和河水中MSSA和MRSA的存在，以评估每个生态位的遗传多样性和优势基因型。

实验部分

样品来源

2011年7月，在一个污水厂采集了一个城市污水样本，该污水厂从一个拥有320万人口的城市核心区的几个城市收集器收集废水(未经处理的废水)(http://www.ine。es / SID Informe.do)。2012年9月，在某城市市辖区下游农村采集了一份河流水样(http://www.ine.es/SID/Informe.do)。

隔离和表征

将两个样本分为子样本，分别进行处理(n=每个样本100个子样本)。每个业者(1毫升)是培养9毫升Muller-Hinton肉汤(6.5%氯化钠,Oxoid)和孵化的37°C - h。一毫升然后转移到9毫升大豆胰蛋白胨肉汤(Oxoid)和头孢西丁(3.5 mg / L, Sigma-Aldrich)和aztreonam (75 mg / L, Sigma-Aldrich)和孵化的37°C - h。最后,25µL在Brilliance MRSA plates (Oxoid)上划线，37°C[10]孵育24-48 h。牛仔蓝菌落(每个亚样本一个)被确认为MRSA (台面式晶体管或作为国内PCR检测[12]。同时，100µL孵育的Muller-Hinton肉液(6.5% NaCl)在Baird Parker (BP)琼脂上与Rabbit Plasma Fibrinogen (bioMerieux)共培养，37℃孵育24-48小时。选择黑色菌落凝固酶阳性(每个亚样本一个)作为潜在菌落金黄色葡萄球菌并确认为金黄色葡萄球菌(台面式晶体管或作为国内阳性)或如上所述的MSSA (mecA和mecC阴性)。经确认的金黄色葡萄球菌通过spa分型测序，蛋白A[12]的变量片段进行特征分析，spa分型采用最小生成树算法(Bionumerics 6.0)进行分析。采用Simpson 's多样性指数(SID)和Jackknife伪值(CI: 95%)估算了该品种的遗传多样性金黄色葡萄球菌基于spa类型的分离株(图2;http://darwin.phyloviz.net/ComparingPartitions/ index . php ?链接=工具)。采用多位点序列分型(MLST)对每个spa型和103个分离路线的至少1个分离株进行分型，以获得[13]前描述的序列类型(STs)。[12]同时检测Panton-Valentine白细胞杀伤素(PVL)。

统计分析

计算Fisher精确检验(SPSS 20)来分析样品类型(城市污水或河水)与MRSA的存在之间的关系，以及样品类型与收集中最常见的spa类型和STs (n>5分离株)之间的关系。

结果与讨论

MRSA方案在城市污水中的100个亚样本中检测出96株MRSA，而在河水中检测出的MRSA仅为33/100(表1)mecA-MRSA。在Baird Parker方案中，金黄色葡萄球菌的大部分分离株为MSSA(表1)，但也检测到一些MRSA(5株)mecA-MRSA和1个分离株mec城市污水中的C-MRSAmec河水中的A-MRSA)。检出率低mecC-MRSA相比mecA-MRSA与其他研究一致[13-16]。然而，检测mec考虑到人畜共患病传播的可能性和野生动物与环境的相互作用，废水中的C-MRSA是值得关注的mecC-positive MRSA[10]。

图1:利用最小生成树算法聚类spa类型。圆圈之间的线/数字代表不同温泉类型之间的遗传距离。(*):在河水中检测到的温泉类型;(^):在城市污水中检测到的温泉类型和():共享温泉类型

表1:河流和城市污水中金黄色葡萄球菌的Spa类型和序列类型[STs]。
MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;MSSA:甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌;^一个PVL积极隔离;^b作为隔离[13];粗体字母:本研究中描述的spa类型和STs

图2:基于spa类型的金黄色葡萄球菌分离株遗传多样性:Simpson 's Index of diversity (Simpson 's ID)和Jackknife伪值置信区间(CI)为95%。MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;MSSA:甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌

只有1株MSSA对PVL呈阳性反应(ST737- spa型t4801)。有研究报道PVL在欧洲南部和西班牙部分地区呈上升趋势，但主要涉及ST8和ST80[18,19]，本研究(表1)中分离频率较低(ST8)或未检测到(ST80)的st。

在城市污水中检出的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株比例较高(102/169;60.4%)高于河水(34/115;29.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)。与河水相比，城市污水中MRSA分离频率较高，这可能与废水中耐药菌浓度较高以及采样地区的人群密度有关[20,21]。

隔离被分组在81个不同的温泉类型(图1)和42 STs, 12温泉类型和14针是常见的两种环境中(表1)。十个新温泉类型和7新STs首先介绍研究(表1)。42中被发现含有不同的温泉类型MSSA隔离从河水在城市废水和35。MRSA菌株的数量不同水疗中心从河水和城市污水中检测到的细菌类型分别为7和13(表1)金黄色葡萄球菌两种水样中的种群。

MSSA的遗传多样性高于MRSA菌株(图2;P < 0.05)。辛普森多样性指数(SID)基于水疗中心来自河流的MSSA菌株为0.958 (95% CI: 0.934-0.981)，来自城市污水的MSSA菌株为0.944 (95% CI: 0.910-0.978)(图2;P > 0.05)。在MSSA分离株中观察到的遗传多样性与以前的研究[1]相似。尽管有较高的遗传多样性，但一些MSSA基因型更容易被分离出来。因此，在河水中检测到的MSSA基因型最多的是ST5/水疗中心t002类型(13/81;16.0%), ST30 /水疗中心类型t012 (6/81;7.4%), ST25 /水疗中心类型t078 (6/81;7.4%)和ST15 /水疗中心类型t084 (5/81;6.2%),而ST30 /水疗中心类型t012 (13/67;19.4%), ST15 /水疗中心类型t084 (7/67;10.4%)和ST30 /水疗中心类型t021 (5/67;7.5%)是城市污水中最常见的MSSA基因型。这些常见的MSSA基因型之前已经在人类健康携带者和患者中发现[1,22,23]。

对来自河流和城市污水的MRSA菌株，SID值分别为0.326 (95% CI: 0.102-0.550)和0.530 (95% CI: 0.412- 0.648) (P>0.05)。这种低遗传多样性是由于主要基因型的存在，包括大多数MRSA分离株。特别是ST125/基因型水疗中心t067型代表了从河水和城市污水中分离出的82.4%(28/34)和67.6%(69/102)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，依次(表1)水疗中心代表与医院感染相关的主要MRSA基因型[1,24]。其他MRSA基因型如ST22-t032和ST5-t002(表1)也与人类感染有关[4,22,24]。在河水和城市污水中发现了LA-MRSA，尽管典型的基因型如ST398/水疗中心t011或其单位点变体ST1094在我们的研究中仅零星发现(表1)。这些结果可能是由于在靠近城市核的采样区域，动物的影响有限。

我们的数据表明，在城市污水和河水中检测到的主要MRSA和MSSA遗传谱系是人类相关基因型。这可能与被定殖个体不断向环境中释放金黄色葡萄球菌的潜力有关[5,6,20]，同时也有能力金黄色葡萄球菌在水环境中持续存在[6,10,25]。

结论

我们的数据强调了人类活动的潜在作用金黄色葡萄球菌并强调有必要评估这种病原体在环境中的循环和持久性及其对公共健康的可能影响。

致谢

这项工作得到了马德里自治社区的部分支持(S0505 / AGR-0265;S2009 / AGR-1489)和欧盟FP7赠款ANTIGONE(项目#278976)。

a . Valverde由西班牙经济和竞争力部的博士后奖学金“Juan de la Cierva”资助。

作者希望感谢Ursula博士Höfle在实地取样方面的帮助，以及J. A. Carriço博士(里斯本大学医学院微生物研究所分子微生物与感染研究所分子微生物研究所)。感谢技术人员María García、Estefania Rivero和Carolina Castilla (VISAVET)提供的卓越技术支持。

没有收到用于支付公开获取出版费用的资金。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。创始发起人在研究设计中没有任何作用;收集、分析或解释数据;在手稿的撰写和发表结果的决定中。

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条信息

Aritcle类型:研究文章

引用:Porrero MC, Valverde A, Mateos A, Cantón R, Gortázar C, et al.(2016)在城市污水和河水中发现的金黄色葡萄球菌遗传谱系。国际废水处理2(2):doi: http:// dx.doi.org/10.16966/2381-5299.117

版权:©2016,Porrero MC，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2015年10月06

接受日期:2016年1月25日

发表日期:2016年2月01