摘要

背景

寻常天疱疮是一种自身免疫性疾病，涉及皮肤和粘膜。抗原的靶点是粘连蛋白，一种在桥粒中发现的钙黏合剂型细胞间粘附分子。免疫球蛋白G抗黏结蛋白3抗体水平与疾病活动性呈正相关。此外，免疫球蛋白G4同型似乎在发病机制中起主要作用。然而，抗连接球蛋白3抗体存在于寻常天疱疮患者在临床缓解期间。我们的目的是测量和比较临床缓解期寻常天疱疮患者与临床活动性疾病患者对粘连球蛋白3的免疫球蛋白G4的反应。

方法

我们包括7名男性和10名女性白人患者的血清，年龄在35-76岁。本研究对既往诊断为寻常性天疱疮的患者(12例临床活动性疾病，14例临床缓解)进行研究，并通过酶联免疫吸附试验检测抗串珠蛋白3自身抗体阳性。采用改进的酶联免疫吸附法检测抗串珠蛋白3(总免疫球蛋白G、免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G4亚类)抗体。间接免疫荧光法检测抗皮肤抗体的免疫球蛋白G亚群。

结果

酶联免疫吸附试验结果显示，临床非活动性疾病患者血清抗栓系球蛋白3免疫球蛋白G4亚类抗体水平低于活动性疾病患者血清(p=0.03)。两组间免疫球蛋白G1比较，差异无统计学意义。同样，两组间间接免疫荧光抗皮肤抗体免疫球蛋白G亚类的存在无统计学差异。

结论

抗粘连蛋白3免疫球蛋白G4亚类自身抗体水平看起来非常适合于比较缓解期患者和临床活跃的寻常性天疱疮患者(p=0.03)。

关键字

寻常天疱疮;Desmoglein;免疫球蛋白G;Anti-skin抗体;酶联免疫吸附试验;间接免疫荧光法;临床缓解期;自身抗体

介绍

寻常天疱疮(PV)是一种引起皮肤和粘膜起泡的自身免疫性疾病。天疱疮的自身免疫靶点是粘连蛋白，这是一种在桥粒中发现的钙粘蛋白型细胞间粘附分子[1,2]。desmoglein 1 (Dsg1)和desmoglein 3 (Dsg3)同型存在于水疱形成[1]的鳞状上皮中。Dsg1和Dsg3的酶联免疫吸附试验(ELISA)的开发使天疱疮的分类取得了进展[3,4]。PV患者存在抗dsg3和抗dsg1 IgG抗体，部分患者仅存在抗dsg3 IgG抗体[5-7]。

除了根据抗体谱鉴定天疱疮亚型外，纤维黏结蛋白抗体的定量与疾病的临床活动呈正相关。在PV患者中，通过ELISA定量Dsg3抗体与疾病的临床活动相似[6,8]。一些研究表明，IgG亚类在PV发病机制中的参与是非常不同的，其中IgG4起主要作用。不同的IgG亚型与不同的功能特性相关，因此可能决定了IgG抗体的致病潜力[3,9-11]。在活跃PV中，针对Dsg3的IgG4自身抗体占优势。IgG4反应对于临床疾病的发展是必要的。在此基础上，水泡的形成不需要补体激活。此外，血清IgG4总量已被证明在天疱疮[12]增加。

这些数据表明，igg4靶向治疗天疱疮可能有有益的效果。静脉注射免疫球蛋白治疗可降低IgG4抗dsg3抗体水平，此作用与改善临床活性[13]有关。此外，B淋巴细胞耗尽疗法在天疱疮等疾病中取得的良好效果与血清IgG4或Dsg3自身抗体水平降低有关[14,15]。

尽管IgG4抗dsg3自身抗体的水平与患者PV的临床活动相关，但在临床缓解期患者中也发现了抗dsg3自身抗体的存在[6,11]。这些数据对这些检测方法在评估疾病活动方面的有效性提出了质疑。此外，这些自身抗体在临床缓解期间的意义还有待讨论。

本研究的目的是评估两组患者抗dsg3抗体的IgG亚类组成，临床缓解患者与临床活动性疾病患者的比较。采用ELISA检测两组患者IgG1和IgG4抗dsg3抗体水平。临床缓解期PV患者血清中IgG4抗dsg3抗体水平低于临床活动性疾病患者血清(p=0.03)。我们还通过间接免疫荧光(IIF)将这些数据与抗皮肤抗体(ASA)的IgG亚类组成进行了比较。

材料和方法

人类血清

我们收集了7名男性和10名女性白人患者的血清，他们的年龄在35-76岁之间，既往通过临床表现、组织学和血清学试验阳性诊断为PV。采用ELISA法筛选出抗dsg3自身抗体阳性的26份血清样本。该项目是在纳瓦拉大学伦理研究委员会的批准下完成的(nº79/2010)。

根据每个患者疾病的活动性将血清分为两组(补充信息)。第一组包括12个在临床活动情况下采集的血清样本，特征是在任何治疗前在皮肤和/或粘膜上存在几个活跃的病变。第二组包括14个临床缓解期收集的血清样本，临床缓解期定义为患者接受低剂量(每天少于15 mg)皮质类固醇作为维持治疗时，皮肤和/或粘膜上没有活动性病变。

第二组的治疗给患者如下:highdose(超过15毫克每天)糖皮质激素(病人P1、P6 P8,票数,P13和好),利妥昔单抗,4周静脉注射剂量的375 mg / m2(病人P4、P5 P12, P15和P16),或静脉注射环磷酰胺冲击治疗(病人P2 7剂量1000毫克剂量;P7, 3次，每次1700毫克;P10, 10次，每次1200毫克)。

为建立抗dsg3、IgG1和IgG4亚类的酶联免疫吸附试验(ELISA)截止值，选择20份健康人血清作为对照。所有血清在−20℃保存。

酶联免疫吸附法检测Dsg3抗体

根据制造商说明，使用Dsg3商用ELISA试剂盒(Euroimmun, Luebeck, Germany)对Dsg3总IgG自身抗体进行定量。除使用标记有山根过氧化物酶的小鼠抗人IgG1或IgG4 (Beckman Coulter Inc, Fullerton, California)作为二抗外，使用相同的商品化Dsg3 ELISA Kit (Euroimmun, Luebeck, Germany)对Anti-Dsg3 IgG1和IgG4亚类进行定量

血清样本从1:100开始连续稀释。在光密度(OD)范围内测定450nm波长的最低稀释量为最佳血清稀释量。每个血清的值用最佳血清稀释时的OD值乘以稀释因子计算。IgG1和IgG4分别稀释为1:1000和1:3000。所有稀释用Dsg3商用酶联免疫吸附测定试剂盒(Euroimmun, Luebeck，德国)提供的样品缓冲液。

当IgG ELISA值大于或等于20相对单位(RU)/mL，即制造商(Euroimmun, Luebeck, Germany)推荐的临界值时，检测值为阳性。在450nm波长下，抗dsg3 IgG亚类的截止波长为IgG1 0.643 OD, IgG4 0.237 OD。这些截断点是根据20份对照血清样本的值分析而确定的。临界值等于平均值加上控制值的2个标准差(SD)。

间接免疫荧光法

采用标准IIF法在猴食管底物上检测抗皮肤抗体(A. Menarini Diagnostics，佛罗伦萨，意大利)。染色程序如下:连续的血清稀释(从1/10到1/640)用于切片30分钟(分钟)。用磁力搅拌器将载玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤10分钟，然后用二抗孵育30分钟。最后洗涤10分钟，包括安装介质。采用灵长类抗人IgG fitc偶联物(Inova Diagnostics Inc, San Diego, California)作为二级抗体进行ASA分析。IgG亚类染色采用小鼠抗人IgG1或小鼠抗人IgG4 fitc标记单克隆抗体(Beckman Coulter Inc, Fullerton, California)作为二级抗体。

统计分析

采用IBM SPSS Statistics v20软件进行统计学分析。数据集的正态性采用Shapiro-Wilk检验进行分析。基于这些结果，我们进行了非参数(MannWhitney U)检验来比较变量。用斯皮尔曼秩相关系数研究了二者的线性关系。在所有情况下，p值<0.05被认为是显著的。

结果

ELISA检测抗dsg3抗体

临床活跃PV患者血清中IgG抗dsg3值(中值为254.5 RU/mL)高于临床非活跃疾病患者血清中IgG抗dsg3值(中值为178.0 RU/mL) (U MannWhitney检验p=0.04，表1)。两组间IgG抗dsg3抗体水平也存在差异。临床活动性疾病患者的IgG1水平(中位值为2.28 OD)高于临床缓解患者(中位值为0.68 OD) (U Mann-Whitney检验p=0.03，见表1)。但两组间IgG1水平差异无统计学意义(中位值分别为0.75 OD和0.71 OD)。综上所述，与临床活动性疾病患者相比，临床活动性PV患者血清中总IgG和IgG4亚类抗dsg3值较低(图1)。

图1:ELISA法测定临床活动性寻常天疱疮患者和临床缓解期患者血清中抗desmoglein 3抗体(antiDsg3)。我们测量了总IgG (A)和IgG1 (B)和IgG4 (C)亚类。数据通过箱形图显示。水平线表示相对单位(RU)/mL或光密度(OD)的中位数(450nm)。

用IIF法检测ASA抗体的总IgG和亚类

我们分析了IIF数据，检测IgG、IgG1和IgG4 ASA。血清稀释具有典型寻常天疱疮荧光模式(猴食道细胞间隙染色)检测为阳性。我们比较了临床缓解期患者与临床活跃期患者的数据(图2)。临床缓解期患者与临床活跃期患者之间的差异无统计学意义。只有asa特异性IgG4有显著性差异(p=0.05, U Mann-Whitney检验，表1)。

图2:临床活动性寻常天疱疮和临床缓解期患者血清抗皮肤抗体(ASA)的IIF测定。我们测量了总IgG (A)和IgG1 (B)和IgG4 (C)亚类。数据通过箱形图显示。水平线表示滴度的中位数。

缩写:ASA: Anti-skin抗体;Dsg3: Desmoglein 3;ELISA:酶联免疫吸附法;IIF:间接免疫荧光法;NS:无显著;OD:光密度;RU/mL:相对单位每毫升

表1:寻常性天疱疮患者抗desmoglein 3和抗皮肤抗体的研究

改良ELISA与常规IIF的相关性分析

IIF和ELISA的数据显示了很好的相关性。IgG1、IgG4抗dsg3与ASA IgG1、IgG4抗体呈显著正相关(R分别为0.74、0.75)。

讨论

我们比较了临床缓解期PV患者与活动性疾病患者血清中IgG1和IgG4抗dsg3抗体的水平。我们还通过IIF研究了两组患者ASA中IgG亚类的分布。ELISA检测到的抗dsg3 IgG4亚类抗体水平在临床缓解期患者中较低，区分了临床活跃PV患者与非活跃疾病患者。IIF检测ASA IgG亚型组间差异无统计学意义。

自ELISA检测到Dsg3抗体后，由于这些数据与疾病的临床活动相关，患者的临床评估变得更容易了[8,17,18]。几种治疗方法用于治疗PV，包括静脉注射免疫球蛋白或B淋巴细胞耗损，这些方法由于其对抗dsg3自身抗体水平的影响而取得了成功[13-15]。此外，IgG亚类之间的区别也有助于更好地理解该病的发病机制[3,9]。IgG4被认为是导致PV[19]组织损伤的IgG亚类。

然而，已多次报道，大量天疱疮患者在临床缓解期存在抗dsg 3抗体[6,11,16,20,21]。这些观察结果对Dsg3抗体测量在评估临床活动中的价值提出了有趣的问题。这些自身抗体在临床缓解期的作用尚不清楚，尽管有几种可能性被提出。一是缓解期循环中残留的自身抗体主要是非致病的而非致病的[16,22]。另一种解释是，使用的免疫抑制治疗导致了疾病的症状抑制，同时也不足以完全阻断自身抗体应答[16]。

anti-Dsg3抗体的存在在临床缓解的病人一起描述致病作用anti-Dsg3 IgG4子类抗体导致我们测试的水平是否anti-Dsg3 IgG4子类抗体PV患者的不同临床缓解相比病人的疾病是临床上活跃。我们发现，与之前报道的[6]相比，在临床缓解期抗dsg 3抗体水平较低。在这份报告中，作者声称，定期监测临床缓解期PV患者的这些自身抗体水平，可能有助于评估疾病活动。我们的研究补充了一些信息，表明PV患者在临床缓解期间IgG4抗dsg3抗体水平也较低。Dhandha等在一组临床缓解的异质PV患者(包括anti-Dsg3阴性患者)中发现，不存在亚类开关，这些患者IgG4和IgG1均维持在高水平。我们发现IgG4抗dsg3的水平在临床缓解患者中较低，但与临床活动疾病患者相比，缓解患者的IgG1水平没有变化。这些差异可能是因为我们的患者在临床缓解期对Dsg3抗体的阳性反应更为一致。

这些发现具有特殊的相关性，因为众所周知IgG4抗体在不同病理条件下具有致病作用[3]。IgG4抗体在PV患者水疱形成中的决定性作用已被证实[9,10]。另一方面，新的治疗措施对PV临床疾病活动的有益影响与IgG4自身抗体水平相关。静脉注射免疫球蛋白治疗可改善PV症状，诱导抗dsg3 IgG4亚类抗体[13]下降。此外，B淋巴细胞消耗疗法，如抗cd20单克隆抗体，在PV患者中产生临床效益，与抗dsg3抗体[15]的下降有关。

有趣的是，抗cd20治疗在IgG4相关病理中的作用与血清IgG4水平[14]的降低有关。我们的数据显示，在低临床活性的患者中，IgG4抗dsg3自身抗体减少，这有助于更好地理解这些发现。根据是否存在临床疾病活动，PV患者之间的IIF数据没有观察到统计学上的显著差异。只有ASA-IgG4亚类滴度有显著差异(p=0.05)。这可能是由于相对于ELISA较低的敏感性，以及两种检测方法的不同特性。

当抗体水平与PV的临床活动程度相关时，测量IgG4抗dsg3自身抗体似乎是一个很好的标记。此外，生物学参数的使用，如IgG 4抗dsg 3的检测，看起来非常适合解释PV患者的新治疗效果。此外，这些抗体在无临床活性时的致病意义值得进一步研究。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:José Antonio Delgado García, Carmen Pérez Robles, Juan José Mata Molanes, Laura Moreno Narro, Paula Arana Berganza(2015)寻常性天疱疮患者IgG4 Anti-Desmoglein 3抗体水平与疾病活动相关。自体免疫感染病，1.1卷:http://dx.doi.org/10.16966/2470-1025.101

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出版的历史:

收到日期:2015年3月16日

接受日期:2015年4月14日,

发表日期:2015年4月20日,